Zastosowanie aparatu coultera do zliczania i rozkładu rozmiaru komórek krwi

Abstract

Analizator hematologiczny Coulter Counter opierający swe działanie na liczniku Coultera pozwala na wykonanie pomiarów wszystkich parametrów krwi wraz z różnicowymi licznikami leu-kocytów oraz zawartościami procentowymi i liczbą neutrofili, limfocytów, monocytów, acydofili, bazofili, również płytek krwi PLT, a także wyprowadzenia dokładnego określenia hematokrytu poprzez podsumowanie objętości erytrocytów określonej na podstawie parametrów przepływu prądu. Urządzenie to wykorzystuje pomiary zmian konduktancji elektrycznej komórek krwi przepuszczanych przez mały otwór apertury. Przejście komórki przez kryzę powoduje powstanie pojedynczego impulsu elektrycznego wykrywanego przez układ elektroniczny pozwalający na monitorowanie przepływu za pomocą oscyloskopu, dzięki któremu możliwa jest segregacja impulsów obrazowanych w postaci pików zależnych od wielkości badanych komórek. Dzięki ustalonym granicom wielkości pików dla poszczególnych komórek, licznik sumuje liczbę kolejnych komórek krwi, pozwalając w efekcie na uzy-skanie miarodajnych wyników obrazu morfologicznego. Dzięki analizatorowi Coultera dzisiejsze badania parametrów krwi są dokładne, gdyż wyeliminowano możliwość wystąpienia błędu ze strony obsługujących maszynę, zaś możliwość porównania z próbką kontrolną pozwala określić, czy parametry krwi danego pacjenta mieszczą się w zakresie przyjętych norm, co pozwala na szybką diagnozę i rozpoznanie pacjentów chorych umożliwiając szybsze poddanie ich leczeniu.
Autor: Katarzyna Zarychta

1. LICZNIK COULTERA.

1.1. ZASADA DZIAŁANIA.

Zjawisko Coultera zawdzięczamy jego odkrywcy Wallace’owi Coulterowi, który dokonywał pomiarów zmian konduktancji elektrycznej, komórek zawieszonych w roztworze soli fizjologicznej przepuszczanych przez mały otwór (1948r.). Wykorzystał on w swym urządzeniu fakt, iż: komórki są relatywnie słabymi przewodnikami,natomiast osocze, w którym te komórki są zawieszone jest dobrym przewodnikiem, komórkowe składniki krwi mogą być oceniane na podstawie jej konduktancji, która spada wraz ze wzrostem stosunku komórek do osocza [1], [6].



Do podstawowych elementów nie elektronicznej części licznika Coultera zaliczamy, jak widać na rysunku(Rys.1.) [4], zbiornik w którym częściowo zanurzona jest rurka w kształcie palca . W pobliżu niższego końca owej tuby, umieszczony jest mały otwór o wiadomej (zadanej) średnicy(tuby te są dostępne w szerokiej gamie rozmiarów otworu). Jeśli rurka ta jest wypełniona do pewnego punktu powyżej poziomu wewnątrz zbiornika , wówczas zawartość rurki powoli spływa przez otwór.

Przywołując zjawisko dynamiki układów, zarówno rurka, jak i zbiornik reprezentują magazyny energii potencjalnej, zaś w czasie przepływu następuje wyrównanie energii potencjalnych (energia kinetyczna jest pomijana dla uproszczenia). W urządzeniu Coultera jest zatem wykorzystywany fakt wyrównania się poziomów cieczy w naczyniach połączonych. Zjawisko to zachodzi dopóki obydwa poziomy nie będą sobie równe, co oznacza, że każda cząstka (na przykład komórki krwi, osadu, czy kultury bakterii ) również przepłynie przez otwór .

Jeśli umieścimy elektrody w rurce i w zbiorniku , prąd elektryczny także będzie przepływał przez otwór (apertury), wraz z cieczą (Rys. 2 ) .



Przepływ ten może być monitorowany za pomocą oscyloskopu, dzięki któremu możliwa jest segregacja impulsów obrazowanych w postaci pików zależnych od wielkości badanych komórek. Obserwujemy dwa znaki „+” i „-” oznaczające użyte dodatkowo elektrody (Rys.1) , a mianowicie :„ + ” oznacza elektrodę w zbiorniku, „ - ” natomiast, oznacza elektrodę w rurce. Elektrody te są wykonane z platyny, która będąc metalem szlachetnym nie ulega elektrolizie w badanym roztworze. Do rurki podłączone są jeszcze dwie inne elektrody, które mają za zadanie wykrywać poziom cieczy w rurce. Są one zwykle oddalone od siebie o odległość, 0,1 ml.

1.2. ZLICZANIE CZĄSTEK

W momencie, gdy menisk traci kontakt z górnym czujnikiem(Rys. 1) licznik zaczyna liczyć, kiedy natomiast menisk traci kontakt z dolnym czujnikiem, licznik przestaje liczyć. Na tej podstawie wiemy zatem, ile cząstek znalazło się w badanej objętości 0,1 ml. Urządzenie dokonuje zliczania , ponieważ kiedy tylko cząstka przechodzi przez otwór, układ elektroniczny wykrywa chwilowy wzrost rezystancji ( częściową przerwę w przepływie prądu ) i obrazuje go w postaci zielonej pionowej linii–piku, który ukazuje się na ekranie.

1.3 SORTOWANIE WEDŁUG ROZMIARóW.

Jeśli małe erytrocyty RBC wchodzą do otworu (Rys.3A), wówczas następuje większy spadek natężenia prądu niż przy wejściu dużych komórek leukocytów WBC(Rys.3B).



W ten sposób przejście RBC powoduje niski zielony pik, zaś przejście WBC powoduje wysoki zielony pik na oscyloskopie, bowiem amplituda impulsu jest proporcjonalna do objetości badanej komórki. W przypadku każdego przejścia cząstki przez otwór obserwujemy powstanie piku, i w efekcie otrzymujemy wykres wszystkich przejść przez kryzę.

1.4 METODYKA AKWIZYCJI DANYCH.

Liczba wszystkich impulsów jest zliczana przez komputer. Osobno przechowywa- ne są dane na temat pików wysokich, w innym miejscu wszystkie wykonane zliczenia a w trzecim suma niskich pików. Na tej podstawie, jeśli odpowiednio wyregulowano czerwoną linię pokazaną na ekranie(Rys.1) pozwalającą na zaklasyfikowanie impulsów, można otrzymać dokładne wyliczenia paramemetrów krwi. [2]

1.5 PRZYKŁADY ZASTOSOWANIA

• Zliczanie komórek drożdży[5] ,
• Monitorowanie czasu powstawania kultury bakterii[4], [6], [7]
• Zastosowanie kanałów jonowych badaniach transportu metabolitów[3].