Metody badawcze stosowane w pomiarach geometrycznych i mechanicznych właściwości erytrocytów człowieka cd.

2. METODY POMIARU ODKSZTAŁCALNOŚCI ERYTROCYTóW

2.1 PODZIAŁ METOD

Nie ma ogólnie przyjętej metody pomiarów i wyznaczania parametrów charakteryzują¬cych zjawisko odkształcania się erytrocytów przy przechodzeniu przez struktury o mniej¬szej od nich średnicy. Różne ośrodki naukowe i medyczne stosują różne techniki, mody¬fikując je w zależności od własnych potrzeb. Istnieje wiele sposobów szacowania ela¬stycznych właściwości błon komórkowych oraz sposobów ilościowego ich opisania. Spotykane w literaturze techniki można bardzo ogólnie podzielić na kilka podstawowych grup:

• met. mikropipetowego zasysania,
• met. filtracyjne,
• met. mikrokanalikowych przepływów,
• met. reometryczne,
• met. wirówkowe.

2.2 NAJCZĘŚCIEJ STOSOWANE TECHNIKI

Metoda mikropipetowego zasysania (Micropipette Aspiration) wykorzystuje mikropi¬pety (mikrokapilary) o śr. 0.5÷4.0 μm, do których z jednej strony przyłożona zostaje stała, kontrolowana manometrycznie, siła ssąca powodująca całkowite wciągniecie poje¬dynczej komórki do wnętrza kapilary. Następnie mierzy się prędkość przepływu komórki w funkcji ciśnienia. Izotropowe napięcie błony erytrocytu obliczane jest z zależności:

gdzie: ∆P- ciśnienie zasysające; dp- wewn. średnica kapilary; dc- średnica sferycznej cz꬜ci erytrocytu poza kapilarą.

Taki sposób pomiaru odkształcalności nie niszczy błony i pozwala na obserwację czasu powrotu komórki do fizjologicznego kształtu. Niestety jest to technika wymagająca dużej precyzji i bardzo czasochłonna. Po-nieważ dziennie możliwy jest pomiar zaledwie 5÷10 pojedynczych komórek, otrzymanie koniecznej liczby pomiarów jest bardzo trudne. Stanowi to poważne ograniczenie, szcze¬gólnie wówczas, gdy chce się porównać moduł elastyczności dwóch lub więcej próbek [6,14,15].

Wydajność powyższej metody podniósł Brailsford et al. [1] stosując zamiast mikropipety polikarbonowy filtr z ilością porów równą 3x107 cm2 o śr. 0.6 μm i utrwalając zassane fragmenty błon komórkowych erytrocytów 2% glutaraldehydem w celu obserwacji ich w mikroskopie skaningowym. Niestety takie działanie powoduje nieodwracalne uszkodzenie erytrocytu. Modyfikacja ta dała początek metodom filtracyjnym.

Metody filtracyjne (Filtration Methods) oszacowywania deformowalności erytrocy¬tów oparte są zwykle na polikarbonowych filtrach membranowych zawierających znaną na cm2 ilość mikroporów o śr. 3÷5 μm i grubości 7÷13 μm. Zawiesina komórek (Hct=5%) przepływa przez pory filtru pod zadanym ciśnieniem. Pomiędzy przyłożonym zewn. ciśnieniem wymuszającym a powierzchnią filtru umieszczony zostaje ciśnieniomierz rejestrujący zmiany ciśnienia zależne od stopnia odkształcalności badanych komórek. W wyniku przepływu całej populacji erytrocytów przez membranę otrzymujemy się całościowy profil przepływu. Rejestracji można również poddać objętość przefiltrowanej zawiesiny w jednostce czasu. Mimo, że znając liczbę porów na jednostkę powierzchni membrany można obliczyć teoretyczny średni czas przeciskania jednej komórki, to technika ta nie dostarcza pełnych informacji odnośnie przepływu pojedynczego erytrocytu przez pojedynczą porę. Problem ten rozwiązuje SER (the Single Erythrocyte Rigidament) [7] oparty na membranie z jedną tylko porą, przez którą kolejno przechodzą wszystkie krwinki. Rejestracja przejścia pojedynczego erytrocytu przez porę dokonywana jest przy wykorzystaniu zogniskowanego strumienia światła, którego modyfikacja pozwala na pomiar indywidualnego czasu przejścia każdej z badanych krwinek.

Rezultaty typowych metod filtracyjnych podają średnią wartość odkształcalności dla całej badanej populacji, nie dostarczając informacji o jej niejednorodności. Evans et al. [2] podaje, że możliwe jest określenie rozkładu deformowalności poszczególnych składowych populacji poprzez odpowiednie matematyczne modele. Informacje o istnieniu subpopulacji i ich właściwościach w pewnym stopniu mogą być uzyskane na drodze pomiarowej przy użyciu popularnej metody filtracyjnej zwanej CTTA (Cell Transit Time Analyzer) [11]. Urządzenie to, będące udoskonaloną wersją SER, wykorzystuje techniki konduktometryczne do badania różnic przewodnictwa elektrycznego pomiędzy komórkami erytrocytów a medium, w którym są one zawieszone podczas przeciskania się przez porę. Rejestracji podlega również pomiar czasu przejścia pojedynczej komórki przez porę. Istnieją jednak wątpliwości co do zdolności CTTA do różnicowania subpopulacji erytrocytów o różnej sztywności błony komórkowej. Ponadto metoda ta nie rozróżnia prawidłowo przepływu przez porę pojedynczej komórki od agregatu oraz jednoczesnego przejścia kilku erytrocytów przez kilka por. Jej zalety zaś to informacja o czasie przejścia pojedynczego erytrocytu przez porę, zrównoważony stały przepływ zawiesiny, możliwość morfologicznej regeneracji komórki wynurzającej się z pory, oraz możliwość pomiarów statystycznie znaczącej próbki.

Lisovskaya et al. [11] oszacowują procent niezdolnych do przefiltrowania komórek w poddanej pomiarom zawiesinie erytrocytów na drodze matematycznej. Definiują oni indeks zdolności filtracyjnych erytrocytów oraz ilość porów nieodwracalnie zatkanych przez znaną ilość krwinek, które to parametry pozwalają na ilościową ocenę odkształcalności komórek.

W latach 90-tych wiele zespołów intensywnie pracowało nad konstrukcją urządzeń z kanalikowym przepływem erytrocytów, które umożliwiałyby fotograficzną rejestrację każdej komórki z osobna. Ostatnio obserwuje się tendencję do poszukiwania metod geometrycznych pomiarów odkształceń erytrocytów na różnym etapie tego procesu. Techniki te jako układ wymuszający odkształcenia wykorzystują system równoległych mikrokanalików (mikrorowków) z kołowym przekrojem czynnym wytrawionych na szklanym, krystalicznym (kwarc) lub silikonowym podłożu [6,15]. Idea zastosowania silikonu opiera się na wykorzystaniu ela¬stycznych właściwości tego materiału, które częściowo odwzo-rowują elastyczność na¬czyń kapilarnych podczas nasilonego przepływu krwi in vivo. Tsukada et al. [16] zaproponowali model przeźroczystych mikrokanalików o przekroju litery „U” wytrawionych na podłożu kwarcowym, których długość wynosi 113 μm, szerokość 9.1 μm i głębokość 5.3 μm. Zrezygnowano z zastosowania silikonu, ponieważ nie posiada on właściwości optycznych umożliwiających obserwowanie kształtu przepływających przez mikrorowki komórek. Wymiary rowków mogą być zmieniane poprzez dobór odpowiedniej płytki z przygotowanego zestawu.

Cenną zaletą tej techniki jest możliwość jednoczesnej analizy zmian kształtu erytro¬cytu dla różnych prędkości przepływu. Odbywa się to dzięki różnej odległości poszcze¬gólnych rowków od miejsca podania zawiesiny erytrocytów na płytkę (Rys.4). Przepływ pojedynczych komórek przez system rowków wymuszony jest przez ciśnienie 20 cmH2O. Rejestracja kształtu krwinki odbywa się za pomocą mikroskopu oraz systemu wysokiej rozdzielczości kamer video (1000 klatek/s), a analiza danych pomiarowych - przy użyciu specjalnego oprogramowania. Stopień obserwowanych odkształceń zależy w oczywisty sposób od ciśnienia, prędkości przepływu i wymiarów mikrokanalików. Badania prze¬prowadzano w taki sposób, aby uniknąć oddziaływania komórek między sobą. Przy za¬stosowanych w projekcie wymiarach kanalików obserwowano zawsze spadochronowaty kształt (parachute configuration) erytrocytów (Rys.3).

Ostatnimi laty prowadzi się badania reometryczne erytrocytów w wykorzystaniem urządzeń zwanych reometrami, za pomocą których mierzy się indeks elongacyjny błon erytrocytów (IE). Krew o objętości max 25 μl zmieszana z dekstranem umieszczana jest pomiędzy dwoma tarczami reometru, z których dolna jest nieruchoma a górna wiruje, oddziaływując na krwinki siłą naprężenia stycznego (shear stress) o zadanej wartości. Wiązka laserowa przechodząc przez wirującą tarczę trafia na wydłużające się komórki, co powoduje dyfrakcję promieniowania, reje¬strowanego i przetwarzanego komputerowo. Szacowanie odkształcenia poszczególnych komórek opiera się na zależności:

gdzie: D-długość komórki, S-szerokość komórki (wartości te określane są procentowo).

Metoda ta nie jest oparta na pomiarze dynamiki przepływu typu „komórka za komórką” w układach modelujących naczynie włosowate, lecz dostarcza informacji o zdolności do odkształcania na podstawie pomiarów geometrycznych grupy erytrocytów poddanych sile ścinającej [6,15].

Metody wirówkowe, wykorzystują siły odśrodkowe działające na odpowiednio przy¬gotowaną zawiesinę erytrocytów umieszczoną w standardowej wirówce laboratoryjnej (16.000 rpm). Konieczność długotrwałego przygotowywania próbki i oszacowanie od¬kształcalności jako średniej wartości dla całej populacji spowodowało, że techniki te uważane są obecnie za historyczne i rzadko się je stosuje. Zainteresowanych odsyłam do literatury [4,5].

Autor: Małgorzata Dzik 

LITERATURA

[1] BRAILSFORD J.D. et al., The aspiration of red cell membrane into small holes, Red cell rheology, 1978, p. 25-38
[2] EVANS S. et al., Leucocyte filterability in peripheral vascular disease, Clin Hemorheology, 1993, vol. 13, p.73-81
[3] CHLUDZINSKA L., ANANICZ E. et al, Near infrared radiation protects the red cell membrane before oxidation, in press
[4] CORRY W.D., MEISELMAN H.J., Centrifugal method of determining red cell deformability, Blood, vol. 51 no. 4 (April), 1978, p.693-701
[5] CORRY W.D., MEISELMAN H.J., Deformation of human erythrocytes in a centrifugal field, Biophys J, vol. 21, 1978, p.1934
[6] DĄBROWSKI Z. et. al., Fizjologia krwi, PWN, 2000, vol. 2
[7] KIESEWETTER H. et al., The single erythrocyte rigidometer (SER) as a reference for RBC deform¬ability, Biorheology, Suppl. I, 1984, p.241-243
[8] KOMOROWSKA M., Fotoprocesy indukowane promieniowaniem z zakresu bliskiej podczerwieni w erytrocytach i modelach błon biologicznych, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, 2001
[9] KOMOROWSKA M., CZYŻEWSKA H., The effect of near infrared radiation on erythrocyte mem-branes: EPR study, Nukleonika. 42 (1997), p. 379-386
[10] KOMOROWSKA M., BIAŁAS W., A. CUISSOT et al., Erythrocyte response to near IR, J. Photochem. Photobiol.B: Biology,68 (2002), p.93-100
[11] LIPOVSKAYA I.L., SHURKHINA E.S. et al., Determination of the content of nonfilterable cells in erythrocyte suspension as a function of the medium osmolality, Biorheology 35:2 (1998), p.141-153
[12] MICHAJLIK A., RAMOTOWSKI W., Anatomia i fizjologia człowieka, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, 2001
[13] MINETTI G., CIANA A., PROFUMO A. et al., Cell age-related monovalent cations content and density changes in stored human erythrocytes, Biochim Biophys Acta 2001 Aug 15;1527(3), p.149-55.
[14] MISSIRLIS Y., BRAIN M., An improved method for studing the elastic properties of erythrocyte mem-branes, Blood, vol. 54, no. 5 (November), 1979, p. 1069-1079
[15] TRACEY M.C.,GREENAWAY R.S., DAS A. et al. , A Silicon Micromachined Device for Use in Blood Cell Deformability Studies, IEEE Trans. Biomed. Eng. 42(8), 1995, p.751-761
[16] TSUKADA K., SEKIZUKA E. et al., Direct Measurement of Erythrocyte Deformability in Diabetes Mellitus with a Transparent Microchannel capillary Model and High-Speed Video Camera System; Mi-crovascular Research 61, 2001, p.231-239
[17] WOLNIEWICZ A. et al. Dziedziczna sferocytoza. Struktura i funkcje szkieletu błonowego erytrocytów., http:// biol-chem.uwb.edu.pl/knb/download/mat-konf/p011-015.PDF