Modelowanie molekularne homodimeru białka ECR

Abstract

Białka EcR i Usp należące do rodziny owadzich receptorów jądrowych wchodzą w skład kompleksu ekdysteroidowego, który w odpowiedzi na zmiany stężenia 20-hydroksyekdyzonu moduluję ekspresję genu kodującego sekwencję białka wiążącego hormon juwenilny. Kompleks ów przyłącza się do DNA w miejscu zwanych hsp27. Wiadomo, że pod nieobecność partnera białko EcR może wiązać się do DNA w postaci homodimeru. Ideą przyświęcającą mojej pracy jest wymodelowanie struktury homodimeru z wykorzystaniem homologii do heterodimerycznych kompleksów białek oraz sprawdzenie tego modelu eksperymentalnie z wykorzystaniem techniki obserwacji zmiany ruchliwości elektroforetycznej w żelu.
Autor: Katarzyna KRĘCISZ

Jednym z celów, jaki przyświeca osobom pracującym naukowo w Zakładzie Biochemii jest zbadanie cech budowy, funkcjonowania kilku białek należących do owadzich receptorów jądrowych. Należy do nich kompleks ekdysteroidowy odpowiedzialny za szeroko pojęte dojrzewanie i przeobrażanie owadów. Kompleks ten jest częścią skomplikowanego mechanizmu regulacji ekspresji genów kodujących białka odpowiedzialne za metamorfozę. Dokładna znajomość zasad rządzących działaniem takich kompleksów pozwoliłaby na próbę skonstruowania swego rodzaju przełącznika pozwalającego włączać lub wyłączać geny. Mogłoby to znaleźć zastosowanie w terapii genowej.

Białka będące receptorami jądrowymi występują przede wszystkim w jądrze, ale można je znaleźć także w cytozolu. W odpowiedzi na sygnały komórkowe modulują ekspresję konkretnych genów. W budowie ich można wyróżnić m.in. takie elementy jak domenę wiążącą DNA (DBD) lub domenę wiążącą ligand.

W skład rozważanego kompleksu wchodzą dwa białka: EcR i Usp. W komórkach owadzich zaobserwowano 3 izoforMy białka EcR. Różnią się one N-końcową częścią. W odpowiedzi na zwiększone stężenie 20-hydroksyekdyzonu (20E) – steroidowego hormonu, białka te (EcR i Usp) tworzą heterodimer, a następnie łączą się do DNA w tzw. regionie hsp27 – obszarze promotora/sekwencji wzmacniającej genu, którego produktem jest białko przenoszące inny hormon mający udział w przeobrażaniu owadów – hormon juwenilny.

Podczas wcześniejszych doświadczeń zaobserwowano, że pod nieobecność partnera białka EcR i Usp mogą się samodzielnie łączyć do elementu hsp27. Usp wiąże się jako monomer, natomiast EcR tworzy homodimer [1,2]. Celem mojej pracy jest wymodelowanie homodimeru białka EcR, a dokładniej jego domen wiążących DNA. W eksperymentach używa się samych domen wiążących DNA zamiast całych białek z kilku powodów. Po pierwsze brak systemu ekspresji, który pozwoliłby otrzymać niezdegradowane, pojedyńcze i oczyszczone białka EcR i Usp z Drosophila. Istnieje także wiele doniesień literaturowych o tym, iż domeny wiążące DNA receptorów jądrowych występujących u kręgowców są dogodnym modelem do badań molekularnych mechanizmów rozpoznawania odpowiednich elementów odpowiedzi na DNA. Ponadto należy pamiętać, iż specyficzne wiązanie receptrów jest podyktowane przez ich domeny wiążące DNA [2].

Stworzenie modelu homodimeru EcR pozwoli na określenie reszt odpowiedzialnych za jego tworzenie. Słuszność hipotezy zweryfikuje się za pomocą eksperymentów na domenach wiążących.

Termin modelowanie molekularne oznacza zaprojektowanie hipotetycznej struktury dla białka o nieznanej budowie na podstawie strukturalnych i funkcjonalnych cech znanych białek jako matrycy. Jest wiele podejść do modelowania molekularnego. W tym wypadku planowane jest modelowanie w oparciu o homologię.

Homologia, w odniesieniu do białek, oznacza posiadanie podobych, homologicznych cech, będących skutkiem posiadania wspólnego, ewolucyjnego przodka. Innymi słowy białka o wspólnym pochodzeniu, pełniące podobne funkcje, należące do jednej rodziny białek będą miały podobne cechy struktury.

Pierwszym etapem modelowania w oparciu o homologię jest identyfikacja białek homologicznych, które wykorzysta się jako matrycę. Szukać białek można w różnych bazach gromadzących struktury 3D oraz sekwencję. Najpopularniejszą z nich jest baza PDB. Po znalezieniu białek wzorcowych należy porównać ich sekwencję, aby określić stopień identyczności, a co za tym idzie homologii. W zależności od użytego algorytmu można szukać reszt identycznych lub podobnych. Porównanie sekwencji pozwala na ustalenie regionów konserwatywych (SCR), które nie różnią się, lub różnią w bardzo nieznacznym stopniu u wszystkich białek z rodziny. Regiony takie obejmują zwykle ważne elementy budowy - np. alfa-helisy czy beta-struktury, lub elementy funkcjonalne – np. reszty katalityczne. Ustala się także regiony zmienne, tzw. pętle.

Kolejnym etapem budowania modelu jest zastąpienie bocznych łańcuchów matrycy przez łańcuchy boczne białka modelowego. Po tej operacji przepisuje się współrzędne atomów położonych w regionach SCR, a następnie określa się możliwe konformacje dla zmiennych regionów. Nastepnie model optymalizuje się – szuka się najniżej energii – najkorzystniejszego stanu energetycznego [3].

Do wymodelowania homodimeru EcR używam modułu Homology zawartego w pakiecie InsightII. Jako matryce wykorzystam struktury krystalograficzne dwóch heterodimerów, które udało się niedawno otrzymać w naszej pracowni. Heterodimery te to EcR/Usp oraz EcR/RXR na elemencie IR-1. Receptor wiążący 9-cis kwas retinowy (RXR) jest ssaczym homologiem USP i wykazano, że te dwa białka mogą być przez siebie zastępowane w kompleksach – wiążą EcR i razem z nim przyłączają się do DNA. Wiadomo także, że Usp może formować heterodimery z naturalnymi partnerami RXR na przykład z receptorem witaminy D3 (VDR). Obserwacja kryształu pokazała, iż powierzchnie dimeryzacyjne w obu kompleksach są właściwie takie same. Użyty element IR-1 jest wyidealizowanym fragmentem DNA z wysokim powinowactwem do badanych białek. Element ten składa się z dwóch konsensusowych połówek (odwróconych palindromów) odseparowanych jedną parą zasad. Element hsp27 również składa się z dwóch połówek oddzielonych jedną parą zasad, ale w tym przypadku mamy do czynienia z niedoskonałym palindromem [2]





Poprawność modelu można zbadać eksperymentalnie wykorzystując do tego celu odpowiednio wykonane mutanty. Po określeniu przypuszczalnych reszt wiążących wyekspresjonuje się białka posiadające resztę alaniny w miejscu wskazanych reszt. Zwykle wykonuje się podstawienie alaniną, gdyż jest to mała, nienaładowana reszta, która nie powinna znacząco wpłynąć na konformację białka, tym, bardziej, iż w tym przypadku będziemy mieli do czynienia z mutacją reszt powierzchniowych.

Zdolność białek do tworzenia kompleksów i wiązania ich do DNA najczęściej bada się techniką zmiany ruchliwości elektroforetycznej w żelu. Technika ta polega na obserwowaniu ruchliwości w elektroforezie znakowanych (najczęściej izotopowo) fragmentów DNA z przyłączonymi do nich białkami. Wykorzystuje się tu fakt, iż szybkość ruchu cząsteczki w żelu jest proporcjonalna do jej wielkości i masy. Tak więc najszybciej będą się poruszały sondy DNA bez związanego białka, a następne w kolejności będą monomery i kompleksy białek.



Technika ta powinna potwierdzić bądź obalić słuszność wymodelowanej struktury z wykorzystaniem modelowania.

 

Autor: Katarzyna KRĘCISZ

LITERATURA

[1] DEVARAKONDA S. et al., Structure of the heterodimeric ecdysone receptor DNA-binding complex. The EMBO Journal Vol. 22 No. 21 pp. 5827-5840, 2003
[2] NIEDZIELA-MAJKA A. et al.., Polarity of the ecdysone receptor complex interaction with the palindromic response element from the hsp27 gene promotor. Eur. J. Biochem. 267, 501-519 (2000) © FEBS 2000
[3] STUDT T. Finding Homology in Structure