Toksyczny wpływ fenylków na błony biologiczne oraz metody wyznaczania parametrów wiązania ligand-receptor cd.

2. METODY WYZNACZANIA STAŁEJ WIĄZANIA I ILOŚCI MIEJSC WIĄŻĄCYCH

2.1.1 METODA SCATCHARDA

Metoda linearyzacji krzywej wiązania ligand/receptor, polegająca na miareczkowaniu stałego stężenia receptorów ze zmienianiem stężenia ligandu. Graficznym przedstawieniem jest stosunek związanego ligandu do niezwiązanego ligandu w funkcji związanego ligandu:


Metoda Scatcharda przekształca równanie (1) do postaci:

B/F = S0/Kd - B/Kd

Można to równanie interpretować w taki sposób, że na osi Y jest wartość B/F w funkcji B [7].Nachylenie wykresu daje stałą powinowactwa wiązania Rys.1.b.; punkt przecięcia z osią określa ilość miejsc wiążących, n [7].Metoda Scatcharda wykorzystuje liniową zależność pomiędzy stosunkiem stężenia związanego ligadu do stężenia niezwiązanego a stężeniem związanego ligandu. Podobną metodę linearyzacji proponuje I.M.Klotz , ale liniowa zależność jest pomiędzy stosunkiem stężenia niezwiązanego ligandu do stężenia związanego ligandu a stężeniem niezwiązanego ligandu [1].


2.1.2 METODA SCHWARZA

W warunkach równowagi, każdy dany wiążący system może być ilościowo opisany przez termodynamiczną izotermę asocjacji (t.j. krzywą wiązania). Z krzywej tej wynika, jednoznaczna funkcyjna zależność pomiędzy związanym ligandem od ilości związanego materiału i koncentracją wolnego ligandu.

Przybliżenie Schwarza opiera się na pomiarach liniowego sygnału ( np. fluorescencji ) przy miareczkowaniu ligandu A ze zmienianiem wiążącego czynnika B. Wykres Schwarza przedstawia F w funkcji Cb /Ca. Mierzony sygnał jest opisany równaniem:


Gdzie CAf -stężenie wolnego ligandu. Współczynnik φ0 jest w założeniu taki sam dla każdego wolnego substratu. Różne stany związanego ligandu przy stężeniu CAi mogą dawać wzrost intensywności różnych sygnałów φ i. Uwzględniając prawo zachowania masy:


można otrzymać:

Ligand jest podzielony między wolne a związane stany i jest to określane jako liniowe zachowanie masy. Stosunek ∆Ф/CB zmienia się razem ze zmianą CB dla kolejnych różnych CA i tworzy pary CA i CB, gdzie wartość tego stosunku jest na takim samym poziomie. Nachylenie i punkt przecięcia osi rzędnych, wykresu liniowego zachowania masy daje stosunek miejsc wiążących oraz stężenie wolnego ligandu [5].

2.1.3 METODA BOBROVNIKA

Bobrovnik w odróżnieniu od najczęściej stosowanych metod Klotza i Scatcharda procedurę miareczkowania stałego stężenia receptorów ze zmienianiem stężenia ligandu zastępuje serią rozcieńczeń kompleksu ligand – receptor. Niech l będzie całkowitym stężeniem ligandu , a całkowite stężenie receptora oznaczy się jako a. Każdy receptor ma n wiążących miejsc dla ligandu, wtedy n*a określa całkowite stężenie wiążących miejsc. Jeśli stan równowagi został osiągnięty i stężenie ligand-receptor wynosi c, wtedy stężenie niezwiązanego ligandu jest równe l-c a stężenie wolnych miejsc na-c. Zgodnie z prawem działania mas:

Jeśli układ zostanie rozcieńczony di razy di >1, to równowaga jest przesunięta w kierunku bardziej dysocjowanych części i nową równowagę opisuje wzór:


Stała równowagi może być uzyskana jako funkcja czynnika rozcieńczenia di. W przypadku, gdy całkowite stężenie ligandu po rozcieńczeniu (lub wzroście stężenia) będzie dużo wyższe niż stężenie kompleksu w stanie równowagi l/di >>ci Bobrovnik otrzymał liniowe zależności pomiędzy: di i 1/cidi, di i a/cidi, di i l/cidi . Po wykreśleniu tych zależności można łatwo określić nachylenie lini prostych i punkty ich przecięć z osiami układu współrzędnych, które pozwalają na określenie wartości K i n [1].